Magyar kutatók, állatorvosok a NÉBIH Állatgyógyászati Termékek Igazgatóságának vezetője Dr. Kulcsár Gábor vezetésével számos tanulmányt jegyez, többek között a magyarországi állatgyógyászati vakcinák szennyezettségéről írt tanulmányt 2010- ben, 2013- ban pedig egy tanulmányt a Száj - és Körömfájás vírusának szándékos terjesztésének ellenőrzése címmel, mint bioterrorizmus fenyegetési eseményt ír le!
Tehát ezek a kutatót állami támogatással és uniós pénzből is kutatnak ilyen témákban, minket meg elhajtott a Belügyminisztérium amikor a gyermekkori oltások vakcina ampulláit akartuk bevizsgáltatni! Nem érdekes?!
“Állatgyógyászati vakcinák vírusszennyeződéseinek vizsgálata Magyarországon”
Szerzők: Kulcsár Gábor, Farsang Attila, T. Soos
Központi Mezőgazdasági Hivatal, Állatgyógyászati Készítmények Igazgatósága, Budapest, Magyarország.
PMID: 20338783
PMCID: PMC7129912
DOI: 10.1016/j.biologicals.2010.01.007
Absztrakt
Az állatgyógyászati vakcinák biztonságossága kiemelkedő fontosságú, és jelentősen veszélyeztetik azt a külső ágensek, például a baktériumok, a mikoplazma, a klamídia és a vírusok. A vakcinagyártás számos kritikus lépése magában hordozza a vírusfertőzés potenciális kockázatát. A vírusok, mint külső ágensek, két fő csoportra oszthatók. Az 1. csoportba tartozó ágensek, mint például a pestisvírus, a csirkeanémia vírus (CAV) és az eggdrop szindróma vírus (EDSV), jól ismertek a gyártók és a hatóságok számára. Összefoglaló kimutatási módszereket, egyértelmű irányelveket és jogszabályokat dolgoztak ki ezen ágensekkel való szennyeződés kockázatának minimalizálása érdekében. Az 1. csoporttal ellentétben a 2. csoportba tartozó ágenseket, mint például a Torque Teno vírust (TTV) vagy az RD114-et, egy replikációképes macska gamma-retrovírust, csak a közelmúltban ismerték fel, és szennyezőanyagként betöltött szerepüket további vizsgálatoknak kell alávetni. Az 1992 és 2009 között használt, véletlenszerűen kiválasztott állatgyógyászati vakcinákat nukleinsav-amplifikációval tesztelték CAV, EDSV és TTV kimutatására. A pestivírus-szennyezettséget 33, 1996 és 2006 között használt vakcinában, valamint további 27, 2007 és 2009 között használt vakcinában vizsgálták véletlenszerűen kiválasztott vakcinákon. A 2007-től kezdődően használt vakcinákon végzett véletlenszerű vizsgálatok mellett 12 élő, Aujeszky-betegség elleni vakcina tételt is teszteltek pestivírusra, amelyeket hivatalos ellenőrzési hatósági tételfelszabadításra (OCABR) nyújtottak be laboratóriumunkba.
1. Bevezetés
Edward Jenner himlővakcina felfedezése óta, amely új fejezetet nyitott a mikrobiális kórokozók elleni küzdelemben, a vakcináció a fertőző betegségek megelőzésének, leküzdésének és felszámolásának legmegvalósíthatóbb és legköltséghatékonyabb módját jelenti [1]. Az állatorvosi vakcinációt kulcsfontosságú tényezőnek tekintik az állatjólét javításában, az élelmiszer-állatok tenyésztési költségeinek csökkentésében és a zoonózisok előfordulásának csökkentésében [2].
A vakcinológia egy mélyen összetett és multidiszciplináris tudománnyá vált, amely magában foglalja az immunológiát, a mikrobiológiát, a molekuláris biológiát, a biokémiát és a statisztikai tudományokat. A szabályozás, a jogalkotás és az etika is fontos szerepet játszik. A vakcinológia összetettségével párhuzamosan a nemzetközi állatgyógyászati vakcinapiac 3,1 milliárd USD-re nőtt.
Biológiai természetük miatt az állatgyógyászati vakcináknak számos szigorú minőségi, hatékonysági és biztonsági kritériumnak kell megfelelniük. A vakcinabiztonság kiemelkedő fontosságú, és jelentősen veszélyeztethetik a külső ágensek, például a baktériumok, a mikoplazma, a klamídia és a vírusok. Az állatgyógyászati vakcinák kritériumait számos szerv szabályozza, és vizsgálati követelményeket határoztak meg a hatásosság, a hatékonyság, a biztonságosság és a tisztaság tekintetében [3]. Az állatgyógyászati vakcina-ellenőrzés szilárd jogalapját magukban foglalják a nemzeti és az európai uniós (EU) jogszabályok, az Állatgyógyászati Készítmények Bizottságának (CVMP) irányelvei, az Európai Gyógyszerkönyv (Ph. Eur.) monográfiái és az Állategészségügyi Világszervezet (OIE) kézikönyve [4] (1. ábra). A gyártók kötelesek a megfelelő gyártási eljárásokat betartani a helyes gyártási gyakorlat (GMP) szerint, és ellenőrizni a kiindulási anyagokat, a törzstenyészet vírust (MSV), a munkatenyészet vírust (WSV), a törzssejt törzset (MCS), a végtermékeket és a termelési eljárásokat (folyamatközi ellenőrzés).
A gyártókon túl az illetékes hatóságok is hozzájárulnak a gyártóhelyek engedélyezésével és ellenőrzésével, bizonyos vakcinák regisztrációs dokumentációinak értékelésével és a késztermékek ellenőrzésével. Bár ezek az erőfeszítések minimalizálják a szennyeződés kockázatát, a vakcinaszennyeződés nem zárható ki. Ezt egyértelműen aláhúzza néhány példa, mint például az emberi felhasználásra szánt élő vakcinák pestisvírus- szennyeződése [5] vagy a Newcastle-betegség vírus (NDV) vakcinatörzseinek jelenléte a különböző élő baromfivakcinákban [6] . Mindazonáltal a külső ágensek listája bővül olyan új tagokkal, mint az RD114 vírus és a Torque Teno vírus (TTV). Az RD114-et először Okada és munkatársai [7] mutatták ki egy macska parvovírus vakcinában, míg egy nemrégiben készült tanulmány [8] szerint 26 sertésvakcinából 6 pozitív eredményt adott TTV-re.
Ez a cikk összefoglalja tapasztalatainkat, amelyeket – mint illetékes hatóság – egyes állatorvosi vakcinák idegen ágensek kimutatására történő tesztelésében szereztünk.
2. Módszerek
2.1 . Tesztelt vakcinák
1996 és 2006 között 33, különböző vállalatok által gyártott, sertések reproduktív légzőszervi szindrómája (PRRS), fertőző szarvasmarhák rhinotracheitise (IBR), Aujeszky-betegség, myxomatózis, lóinfluenza (EI), macska rhinotracheitise, macska panleukopéniája, macska calicivírusa és kutya parvovírusa elleni vakcinát választottak ki véletlenszerűen, és tesztelték pestivírusra. 2007 óta 12 élő Aujeszky-betegség elleni vakcinatételt teszteltek pestivírusra reverz transzkriptáz-polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) a hivatalos ellenőrző hatósági tételfelszabadítás (OCABR) keretében. Az OCABR-vizsgálatokon túlmenően szúrópróbaszerűen 27 tételt vizsgáltak a 2007 és 2009 között Magyarországon használt hét különböző, sertés parvovírus, sertés erysipelas, IBR, PRRS, kutya parvovírus és macska panleukopénia elleni vakcinából. Ezen kívül véletlenszerűen kiválasztottunk 27 baromfivakcinát, nyolc különböző gyártótól származó, 1996 és 2009 között Magyarországon használt baromfivakcinát, és PCR segítségével megvizsgáltuk a csirke anaemia vírus (CAV) és a tojáshullás szindróma vírus (EDSV) jelenlétére. Összesen 35 különböző vakcinát, köztük az összes fent említett baromfivakcinát vizsgálták TTV-re (1. táblázat). A véletlenszerű kiválasztás miatt csak egy PRRS-vakcinát és az OCABR-nek küldött és pestivírusra vizsgált Aujeszky-féle betegség elleni vakcina két tételét vizsgálták TTV-re.
2.2 . Állatkísérlet
Három, körülbelül 12 kg súlyú, két hónapos Kahyb fajtájú sertést (magyar lapály hibrid) vásároltunk egy kereskedelmi célú tenyészfarmról. Két állatot a 0. napon tízszeres dózisú Aujeszky-betegség elleni vakcinával oltottunk be, míg a harmadik állatot kontrollként használtuk. A 70. napon vért vettünk tőlük, és vírusneutralizációs vizsgálatot végeztünk rajtuk.
2.3 . Vírusneutralizációs vizsgálat
A vakcinázott sertésekből származó szérumok neutralizáló antitest aktivitását 96-lyukú mikrotiter lemezen (Dialab Kft., Magyarország) határoztuk meg hörcsög vese (BHK) sejtek felhasználásával. A lyukakat citopatogén hatás szempontjából vizsgáltuk, és a szérum neutralizációs titerét a vírusaktivitás 50%-át semlegesítő szérum végső hígításának reciprokaként fejeztük ki.
2.4 . PCR
2.4.1 . Pestivírus PCR
A Pestivirus törzsek kimutatására a Vilcek és munkatársai által publikált termoprofilt és primereket [9] használtuk. Az RNS-t Trizol™-lal (Invitrogen) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. A cDNS-t 25 μl oldatban szintetizáltuk, amely 8 μl dietil-pirokarbonáttal (DEPC) kezelt vizet, 5 μl 5× RT puffert, 0,5 μl 10 mM dNTP-t, 0,02 U random primert (Promega), 1 U RNS-t (Promega), 10 U MLV-RT (Promega) enzimet és 5 μl RNS-t tartalmazott. A PCR amplifikációs reakciót 50 μl oldatban végeztük, amely 0,5 μl-t tartalmazott mindegyik 10 mM dNTP-ből (Promega), 15 pmol-t mindkét primerből, 5 μl 10× PCR puffert (100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl és 1 mg/ml marhaszérum albumin (BSA)), 2 mM MgCl2 -t (50 mM), 1 U Taq polimerázt (Promega) és 3 μl cDNS-t.
2.4.2 . CAV és EDSV PCR
A CAV PCR-t Tham és Stanislawek [10] által publikált primerekkel és termoprofillal végeztük egy módosított reakcióelegyben, amely 5 μl 10× PCR puffert (100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl és 1 mg/ml BSA), 1 μl MgCl2 -t (50 mM), 0,5 μl-t mindegyik dNTP-ből ( egyenként 10 mM, Pharmacia), 20 pmol-t mindkét primerből, 2 U Taq polimerázt (Invitrogen) és 5 μl DNS-t tartalmazott ddH2O - val, 50 μl össztérfogatig.
Az EDS PCR-t Xie és munkatársai [11] szerint végezték , egy módosított reakcióelegyet használva, amelyet közvetlenül az injekciós üvegből történő vakcina amplifikációra optimalizáltak. A reakcióelegy 5 μl 10× PCR puffert (100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl és 1 mg/ml BSA), 3 μl 50 mM MgCl2 -t , 0,5 μl-t mindegyik dNTP-ből (10 mM mindegyik, Pharmacia), 15 pmol-t mindkét primert, 2 U Taq polimerázt (Invitrogen) és 5 μl DNS-t tartalmazott, ddH2O - val kiegészítve, 50 μl össztérfogatig . A CAV és EDSV PCR DNS-ét Trizol™-lal (Invitrogen) extrahálták a gyártó utasításai szerint.
2.4.3. TTV PCR
Egy 230 bp-os amplikont kaptunk Kekarainen és munkatársai által publikált beágyazott primerkészlet és termoprofil felhasználásával [12] . Módosított reakcióelegyet alkalmaztunk, amely 5 μl 10× PCR puffert (100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl és 1 mg/ml BSA), 3 μl 50 mM MgCl2 -t , 0,5 μl-t mindegyik dNTP-ből (10 mM mindegyik, Pharmacia), 20 pmol-t mindkét primerből, 2 U Taq polimerázt (Invitrogen) és 3 μl DNS-t tartalmazott ddH2O - val kiegészítve, 50 μl össztérfogatig. A TTV PCR-hez szükséges DNS-t Trizol™-mal (Invitrogen) extraháltuk a gyártó utasításai szerint.
2.5. Vizualizáció és szekvenciaelemzés
A vizualizációhoz 8 μl PCR-terméket elektroforézisnek vetettünk alá 2%-os agaróz gélben. Az elektroforézis után a géleket etídium-bromiddal festettük, majd ultraibolya fény alatt vizsgáltuk. A PCR-termékeket a Biomi Kft. szekvenálta, a nukleotid- és a levezetett aminosav-szekvenciákat pedig a BioEdit 7.0.9.0 szoftver [13] segítségével, Clustal módszerrel illesztettük egymáshoz.
3. Eredmények
3.1 . Pestivírus-tesztek
A tesztelt vakcinák egy Aujeszky-kór vakcina kivételével mentesnek bizonyultak a pestivírustól. Annak megállapítása érdekében, hogy az RT-PCR-rel kapott pozitív eredmény laboratóriumi szennyeződésnek tudható-e be, az RT-PCR teszteket megismételték; ugyanazt az eredményt kapták. További lépésként az adott vakcina egy új fioláját feloldották, és két fogékony sertést vakcináztak és figyeltek meg egy kontrollállattal együtt. A fogékony állatok szérumát vírusneutralizációs vizsgálathoz használták a vakcina pestivírus- szennyeződése által kiváltott neutralizációs antitestek titerének tesztelésére , de neutralizációs aktivitást nem találtak.
3.2. TTV-tesztek
A PCR 5 baromfi- és 10 emlősvakcinában mutatott ki TTV nukleinsavat. Mind az öt pozitív baromfivakcina élő, NDV-vírust tartalmazó vakcina volt , amelyek lejárati dátuma 1997 és 2004 között volt. A 10 TTV-pozitív emlősvakcina közül 6 élő CPV-vírust tartalmazó vakcina volt, köztük egy archív vakcina, amelynek gyártását leállították. Egy élő PRRS-vakcina és két macska panleukopenia vírus elleni vakcina is pozitív eredményt adott. Minden vakcinát háromszor újra teszteltek, megerősítve a pozitív TTV-eredményeket.
A TTV jelenlétét ezekben a vakcinákban közvetlen szekvenálással igazolták, és kimutatták, hogy a szennyező vírus a sertés TTV 2-es genocsoportjába tartozik, de a primerek egy nagyon konzervatív genomiális régióban helyezkedtek el. Ezért további vizsgálatokra van szükség a szennyező TTV vírusok jobb tipizálásához.
3.3. CAV és EDSV vizsgálatok
PCR-tesztet végeztek nyolc különböző gyártótól származó, Magyarországon használt baromfivakcinán. Valamennyi vizsgált vakcina negatívnak bizonyult mind a CAV, mind az EDSV esetében.
4. Következtetések
A vírusok mint idegen kórokozók két jól megkülönböztethető csoportot alkotnak. Az 1. csoportba tartozó kórokozók, köztük a pestivírus, a csirkevírus (CAV) és a tojáshullás szindróma vírus (EDSV) jól ismertek a gyártók és az illetékes hatóságok számára. A fertőzés kockázatának minimalizálása érdekében összetett kimutatási módszereket, egyértelmű iránymutatásokat és jogszabályokat hoztak létre. A jól ismert 1. csoportba tartozó kórokozókkal ellentétben a 2. csoport új potenciális szennyezőanyagokat tartalmaz, mint például a TTV és/vagy RD114 vírus, amelyekről nemrégiben derült ki, hogy jelen vannak a vakcinákban. Ezeket az új kontamináns kórokozókat főként tudományos kutatócsoportok mutatták ki nukleinsav-amplifikációs tesztek (NAT) segítségével, hangsúlyozva a kutatás kulcsfontosságú szerepét mind az új vírusok felkutatásában, mind az új, jobb kimutatási módszerek fejlesztésében és értékelésében.
Az állati eredetű kiindulási anyagok, beleértve a szarvasmarha-szérumot, az SPF-tojásokat és/vagy a különböző szöveteket, mint például a CrFK, számos immunológiai állatgyógyászati készítmény előállításának alapvető összetevői, de a szennyeződés egyik fő forrását is jelentik. A szarvasmarha-szérum használatával kapcsolatos egyik specifikus kockázat a kész vakcina szennyeződése szarvasmarha-vírusos hasmenés vírusával (BVDV), míg a CAV és az EDSV hasonló veszélyt jelent a baromfivakcinákra a szennyezett tojásokon keresztül. Az RD114 szennyeződés lehetséges forrása az endogén retrovírus- érzékeny sejtvonalak, például a CrFK [14] használata, amelyet széles körben használnak kutyavakcinák előállítására , különösen a kutya koronavírusa és parvovírusa ellen . A TTV veszélyeztetheti a vakcinák biztonságosságát a szennyezett szarvasmarha-szérum és a szarvasmarha- vagy sertéseredetű szennyezett szövetek révén. A TTV széles körű fajelterjedése miatt a madárvakcinákat is érintheti a TTV-szennyeződés.
Ezen ágensek jelentőségét jelenleg alábecsülhetik. Házimacskáknál a macska szarkómáiban és limfómáiban kimutatták az RD114 vírus mRNS szintjének fokozott expresszióját , de tumorokat csak egy másik macska retrovírussal való egyidejű fertőzés esetén találtak [15]. A mai napig nincs bizonyíték arra, hogy az RD114 vírus szerepet játszana a fibroszarkóma kialakulásában természetes gazdaszervezetében, azonban számos endogén retrovírus okozhat tumorokat [16], [17], [18], és a retrovirális onkogének hiánya egy endogén retrovírusban nem zárja ki a neoplasztikus potenciált; a virális LTR fokozhatja a szomszédos sejtes gének, például a protoonkogének expresszióját. A tumorfejlődés a provirális integrációs helytől is függhet.
Egyre több bizonyíték van arra, hogy a TTV összefüggésbe hozható bizonyos betegségekkel, mint például a sertéseknél az elválasztás utáni multiszisztémás sorvadásos szindróma (PMWS), valamint az embereknél a rhinitis , az asztma, a májbetegség, a hasnyálmirigyrák és az idiopátiás gyulladásos myopathiák [19], [20], [ 21 ], [22], [23],[ 24], [25]. Hangsúlyozni kell, hogy a TTV képes vertikálisan terjedni emberekben és sertésekben [26], [27].
Az RD114, a TTV és minden más „új” idegen ágens egyértelműen alaposabb vizsgálatot igényel. Szükség van a vírusciklus vizsgálatára, prevalencia vizsgálatokra és hatékonyabb kimutatási módszerek kidolgozására, valamint szabályozási megközelítésre ezen új szennyező anyagok kezelésére.
A pozitív PCR-eredmények értelmezése összetett és gyakran további vizsgálatokat igényel, figyelembe véve azt a tényt, hogy a NAT nukleinsavat, és nem fertőzőképességet mutat ki, valamint a téves pozitív eredmények kizárása érdekében. Pestivírus- szennyeződés esetén az Európai Gyógyszerügynökség (EMEA) CVMP-je kiadott egy irányelvet [28] a pozitív PCR-eredmények értelmezéséről és a szükséges intézkedésekről (2.táblázat). Ezen irányelv szerint a pozitív PCR-teszteket in vivo vizsgálattal kell megerősíteni annak megállapítására, hogy az eredmény a BVDV, a klasszikus sertéspestis vírus (CSFV) vagy az élő, ép virion genomiális fragmentumának köszönhető-e.
RD114 és/vagy TTV pozitív PCR-eredménye esetén az eredmények értelmezéséhez eseti megközelítés szükséges. Az állatkísérleteket egyértelműen nehezíti, hogy az RD114 természetes gazdaszervezetében apatogén; a TTV sem okoz érzékelhető tüneteket.
Összefoglalva, ez a tanulmány megállapította, hogy a TTV számos vakcinában jelen volt, beleértve – meglepő módon – a madárvakcinákat is. Bármely külső ágens jelenléte jelentős hatással lehet a vakcina biztonságosságára. A 2. csoportba tartozó külső ágensek esetében azonban további mélyreható elemzésre van szükség annak tisztázására, hogy ezek a vírusok milyen hatással lehetnek a vakcina minőségére és biztonságosságára. Szabványosított protokollokra van szükség az injekciós üvegekben való kimutatásukra, valamint egyértelmű iránymutatásokra a hatóságok és a gyártók számára arról, hogyan reagáljanak a vakcina kiindulási anyagaiban vagy a késztermékekben való jelenlétükre.”
További részletek és hivatkozások a tanulmányban:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1045105610000084?via%3Dihub
Ugyanezen szerzők másik tanulmánya 2013- ból
“A ragadós száj- és körömfájás vírus szándékos terjesztésének ellenőrzése”
Szerzők: Farsang Attila , Hendrik Frentzel, Kulcsár Gábor és Soós Tibor
2013. augusztus 24.
“Absztrakt
A ragadós száj- és körömfájás (FMD) az egyik legrettegettebb határokon átnyúló állatbetegség. A kórokozó véletlen vagy szándékos kibocsátása közvetlen és közvetett hatásokkal járhat, amelyek hatalmas gazdasági veszteségeket és zavarokat eredményeznek. A száj- és körömfájás kitörésének közvetlen hatásai közé tartoznak a mezőgazdasági termelés azonnali veszteségei és a helyi gazdaságok megzavarása, míg a közvetett hatások főként a betegség elleni védekezési intézkedésekhez kapcsolódnak, mint például a piacra jutás korlátozása helyi és globális szinten, valamint a betegség elleni védekezés magas költségei. Az Európai Unió (EU) állati bioterrorista fenyegetésekkel szembeni védekezési képességének javítása érdekében indult el az AniBioThreat, amely különösen az élő állatokat, a takarmányokat és az állati eredetű élelmiszereket fenyegető veszélyekre összpontosít. A projekt részeként számos zoonózis- vagy állati patogén kórokozót vizsgálnak különböző szempontok szerint. Az egyik vizsgált kórokozónak a száj- és körömfájás vírusát választották, mivel rendkívül fertőző, és egy járvány kitörése súlyos gazdasági
következményekkel járhat. A szándékos járványkitörés elleni küzdelem módjait a száj- és körömfájás példáján keresztül lehet bemutatni. Ebben a cikkben a száj- és körömfájás vírus virológiáját és járványtanát tárgyaljuk, különös tekintettel a kapcsolódó bűnüldözési szempontokra.”
További részletek a tanulmányban: https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/bsp.2013.0001
